Resumo do artigo Aspectos analíticos da determinação de cotinina em matrizes biológicas

              A análise cromatográfica de substâncias presentes nestes tipos de matrizes (soro, plasma, urina, etc), em geral, requer um pré-tratamento da amostra. As razões para isso são inúmeras, destacando-se a complexidade das matrizes biológicas, das quais os compostos são obtidos, a existência de proteínas que são incompatíveis com as colunas cromatográficas e a concentração das substâncias a serem analisadas, a nível de traço. As técnicas de extração e/ou pré-concentração permitem que a análise dos componentes de interesse se torne possível. A meta final é a obtenção de uma sub-fração da amostra original enriquecida com as substâncias de interesse analítico, de forma que se obtenha uma separação cromatográfica livre de interferentes, com detecção adequada e um tempo razoável de análise.

A nicotina é o maior constituinte das folhas do tabaco do gênero Nicotiana tabacum L., quimicamente, é uma amina terciária composta de anéis piridina e pirrolidina. Apenas de 10 a 20% de toda nicotina inalada é excretada sob a forma inalterada e os principais produtos de biotransformação da nicotina são cotinina, trans-3’-hidroxicotinina, trans-3’-hidroxicotinina glicuronídeo, nicotina-1’-N-óxido, e piridilcarbinol.

Foi encontrada uma correlação positiva entre a quantidade de cotinina presente na urina de crianças e a quantidade de cigarros consumidos por seus pais. A presença de cotinina em fluidos biológicos é atribuída apenas à exposição à nicotina, uma vez que esse produto é formado especificamente na biotransformação do alcalóide, sendo assim considerado um biomarcador específico. Esta pode ser determinada na urina, plasma, saliva e cabelo. A meia-vida da cotinina e nicotina é aproximadamente 19 e 2 horas, respectivamente.

Devido ao seu pKa (em torno de 4,5), a cotinina apresenta-se em maior quantidade sob a forma não ionizada no sangue (pH 7,4) e na forma de base livre é fracamente solúvel em lipídios, apresentando baixa taxa de distribuição para os tecidos, o que parcialmente explicaria sua existência prolongada no sangue, outro fator que contribuiria para a sua meia-vida prolongada é a baixa taxa de excreção renal em relação à nicotina. Consequentemente por causa de sua meia-vida mais longa, a cotinina é frequentemente o marcador de escolha para demonstrar a exposição à fumaça do cigarro.

A cotinina é geralmente determinada na urina, como amostra de escolha, por ser uma amostra biológica de fácil obtenção, baixa viscosidade e fácil manipulação quando comparada com o sangue e a saliva, sendo considerada uma amostra de coleta relativamente não invasiva e sem risco ocupacional a saúde, além das concentrações do analito nesse fluido serem maiores, em relação a outras matrizes, cerca de 80 a 90% da dose de nicotina absorvida pode ser quantificada na urina.

Não há um valor de referência estabelecido para a cotinina em matrizes amostras biológicas, porém foi demonstrado que valores de cotinina urinária acima de 100 ng/mL indicam fumantes ativos. Uma concentração de 22,5 ng/mL de cotinina na urina qualifica uma pessoa como fumante passivo, enquanto, valores de cotinina abaixo de 5 ng/mL indicam não exposição a fumaça ambiental de cigarros.

            Os procedimentos de extração da cotinina geralmente envolvem a ELL ou EFS, sendo que ambas as técnicas usam volumes consideráveis de solvente orgânico (2-15 mL), os quais são evaporados para concentrar os analitos. Por isso, a seleção do solvente é uma das etapas críticas no preparo de amostras contendo a cotinina. Como a cotinina é uma substância instável e os níveis encontrados são da ordem de ng/mL, são procedimentos comuns, para toda a vidraria a ser utilizada na análise, a lavagem e descontaminação prévia com detergentes alcalinos, ácidos e soluções sulfocrômicas e a posterior silanização. No preparo de amostras para a análise de cotinina, para a análise cromatográfica, pode ser adicionado um padrão interno, que minimiza os erros decorrentes do método analítico, constituído das técnicas de preparo de amostras e de detecção/ quantificação do analito.

            Na extração líquido-líquido, a cotinina é extraída de fluidos biológicos após alcalinização do meio com hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou carbonato de sódio e posterior adição de um solvente orgânico. O solvente mais comumente utilizado é o diclorometano, sendo este um solvente apolar, ele consegue extrair substâncias apolares, como a cotinina após sofrer hidrólise.

            A extração em fase sólida, apesar de produzir dependendo do sorvente utilizado, uma recuperação mais baixa do que a ELL, a EFS vem sendo aplicada em virtude da seletividade, resultando em extratos mais limpos. O solvente usado na eluição da cotinina depende do sorvente empregado porém, o diclorometano isolado ou em misturas, com metanol e/ou hidróxido de amônia, é comumente utilizado.  

            A utilização de técnicas cromatográficas é preferencial para a determinação de cotinina em matrizes biológicas uma vez que essas apresentam baixo limite de detecção e alta seletividade, possibilitando a análise simultânea de nicotina, cotinina e trans-hidroxicotinina, entre outros.

            Os métodos analíticos desenvolvidos para a determinação de cotinina devem apresentar baixo custo e simplicidade analítica, além da detectabilidade e seletividade satisfatórias, uma vez que esse biomarcador é ferramenta que contribui para estimar a exposição à nicotina, ativa ou passivamente.

Bibliografia

MALAFATTI, L.; MARTINS, I. Aspectos analíticos da determinação de cotinina em matrizes biológicas. Revista Brasileira de Toxicologia v. 22, n.1-2, p. 9-20, 2009. Disponível em: http://iah.iec.pa.gov.br/iah/fulltext/lilacs/ revbrastoxicol /200 9 v 22n1-2/revbrastoxico2009v22n1-2p9-20.pdf. Acesso em: 16 de agosto, 2011.