Validação de Métodos Analíticos

  É fundamental que os laboratórios demonstrem, através da

VALIDAÇÃO, que os métodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida.

                                  

 Validação = Confiabilidade analítica

                   

      O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos.

        - Essas informações aplicam-se a:

•  Técnicas analíticas que façam uso de métodos de cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);

•  Métodos não-cromatográficos, desde que estes ofereçam uma seletividade aceitável (por ex. titulometria, espectrofotometria UV-VIS);

• Testes imunológicos ou microbiológicos, desde que observado o grau de variabilidade usualmente associado a estas técnicas;

• Para a garantia da qualidade analítica dos resultados, todos os equipamentos utilizados na validação devem estar devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados;

•  Deve-se utilizar substâncias de referência oficializadas pela Farmacopéia Brasileira ou, na ausência destas, por outros códigos autorizados pela legislação vigente;

• A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar:

•      Especificidade e Seletividade

- É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

- Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes.

- Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de amostras (fármaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais.

•       Linearidade

- É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.

- Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes.

- Se houver relação linear aparente após exame visual do gráfico, os resultados dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Se não houver relação linear, realizar transformação matemática.

- O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) que deve ser em cerca de 0,99.

-Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matemático).

•       Precisão

- È a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis:

  - Repetibilidade: concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação.

  - Reprodutibilidade: concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica.

  - Precisão intermediária: concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

- A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5%.

•            LD

-Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

-No caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação, comparação de cor), esta determinação pode ser feita visualmente, onde o limite de detecção é o menor valor de concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor, turvação, etc).

- No caso de métodos instrumentais (CLAE, CG, absorção atômica), a estimativa do limite de detecção pode ser feita com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de base. Pode ser determinado pela equação:

-Em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco; IC é a inclinação da curva de calibração.

•            LQ 

-É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

-O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação:

Em que:

 DPa é o desvio padrão

IC é a inclinação da curva de calibração

.-Também pode ser determinado por meio do ruído. Neste caso, determina-se o ruído da linha de base e considera-se como limite de quantificação aquela concentração que produza relação sinal-ruído superior a 10:1.

•       Intervalo

-O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende da aplicação pretendida do método.

•      Exatidão

-A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro.

-A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança.

-A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente:

•            Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal.

 Tabela 1 - Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico:

Preparo das Amostras	·Estabilidade das soluções analíticas ·Tempo de extração
Espectrofotometria	·Variação do pH da solução ·Temperatura ·Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia Líquida	·Variação do pH da fase móvel ·Variação na composição da fase móvel ·Diferentes lotes ou fabricantes de colunas ·Temperatura ·Fluxo da fase móvel
Cromatografia Gasosa	·Diferentes lotes ou fabricantes de colunas ·Temperatura ·Velocidade do gás de arraste

Bibiografia

• SIQUEIRA-MOURA, Marigilson Pontes de; LIRA, Mariane Cajubá Britto and  SANTOS-MAGALHAES, Nereide Stela. Validação de método analítico espectrofotométrico UV para determinação de ácido úsnico em lipossomas. Rev. Bras. Cienc. Farm. [online]. 2008, vol.44, n.4, pp. 621-628. ISSN 1516-9332. Disponível em http://www.scielo.br/pdf/rbcf/v44n4/v44n4a08.pdf 

 

• Lasmar, Marcelo Carvalho e Leite, Edna Maria Alvarez. Desenvolvimento e Validação de hum Método cromatográfico fase gasosa los parágrafo Análise da 3,4-metilenodioximetanfetamina (ecstasy) e Outros Derivados anfetamínicos los Comprimidos. Rev. Bras. Cienc. Farm. [online]. 2007 vol.43, n.2, p. 223-230. Disponível em http://www.scielo.br/pdf/rbcf/v43n2/07.pdf

• ANVISA, Guia para Qualidade em Química Analítica – Uma Assistência a Acreditação, v. 1, 1. ed, Brasília, 2004. Disponível em http://www.anvisa.gov.br/reblas/III_enc_desenvolvimento_anal%EDtico.pdf

• BRASIL, Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". DiárioOficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003. Disponível em http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm